Dla biologii molekularnej rok 1983 był rokiem przełomowym. Wtedy właśnie Kary Banks Mullis opracował technologię umożliwiającą kopiowanie specyficznych sekwencji DNA.. To co dotychczas wymagało niejednokrotnie całych tygodni wytężonej pracy stało się nagle dziecinnie proste i ogólnodostępne. Dzięki technice nazwanej PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) możliwy stał się ogromny, a co najważniejsze szybki postęp w takich dziedzinach jak: genetyka, paleontologia, medycyna, kryminalistyka i wielu innych.

Widząc jak wielkie znaczenie dla współczesnej nauki ma reakcja PCR, warto przyjrzeć się dokładniej na czym ona właściwie polega.

PCR jest metodą pozwalającą na wybiórcze powielenie danego fragmentu DNA.Niezwykle istotnym jest, iż przy jej stosowaniu nie jest konieczne oddzielenie powielanego fragmantu od reszty sekwencji. Polimeryzacja DNA następuje dzięki odpowiednio dobranym starterom. Są one dobierane w sposób umożliwiający powielenie jedynie fragmentu DNA znajdującego się między parą starterów „forward" i „reverse".

PCR może trwać nawet kilka - kilkadziesiąt cykli, z których każdy składa się z następujących etapów:

— Denaturacja

W jej trakcie dochodzi do rozerwania wiązań wodorowych między niciami DNA. Temperatury denaturacji w poszczególnych cyklach są różne. Pierwsza denaturacja jest najdłuższa. Ma to na celu umożliwienie całkowitego rozdzielenia nici na całej długości cząsteczki. Temperatura z reguły jest zbliżona do ok. 95 ^oC. Zależy ona w głównej mierze od składu powielanego fragmentu oraz od wytrzymałości użytej polimerazy na wysokie temperatury. W przypadku fragmentów zawierających przewagę par C-G (cytozyna — guanina) do rozdzielenia nici należy użyć wyższej temperatury. Wymusza to użycie polimeraz termostabilnych. Średni czas denaturacji wynosi ok. 30 sekund.

— Przyłączanie starterów (Annealing)

Przyłączanie starterów jest procesem wymagającym do prawidłowego przebiegu temperatury zdecydowanie niższej niż w przypadku denaturacji. Wynosi ona z reguły około 50 ^oC, tym samym jest niższa od wyliczonej temperatury topnienia starterów o ok. 3 — 5°C. Gdy startery mają różne temperatury topnienia, oczywiście wybierana jest ta niższa. Zbyt niska temperatura prowadzi do powstania niespecyficznych produktów, natomiast zbyt wysoka obniża wydajność reakcji.

Przyłączanie starterów przebiega według następującego schematu:

Starter F (forward) tworzy nić komplementarną do nici 3' — 5', natomiast starter R (reverse) do nici biegnącej od 5' do 3'.

— Elongacja (Extension)

Wydłużanie łańcucha DNA zachodzi w temperaturze wyższej niż w przypadku wiązania primerów i odpowiedniej dla używanej polimerazy. Temperatura ta z dla najpopularniejszych polimeraz mieści się w granicach 70 — 80⁰C. W trakcie tego procesu wykorzystywane są deoksyrybonukleotydy dNTP w środowisku dwudodatnich jonów magnezu. Czas potrzebny na powielenie danego fragmentu nici DNA przez polimerazę oblicza się na podstawie długości badanego fragmentu. Na prykad dla polimerazy Taq przyjmuje się średnią prędkość elongacji rzędu 1000 nukleotydów na minutę. (Jest to połowa maksymalnej prędkości powielania w optymalnych warunkach).

Prawidłowy wynik reakcji PCR jest warunkowany odpowiednim doborem starterów, środowiska reakcji oraz czasu trwania poszczególnych jej etapów.

W skład mieszaniny reakcyjnej w reakcji PCR wchodzą następujące odczynniki:

— matryca DNA — cząstka DNA, która ma zostać powielona,

— bufor - tworzący środowisko rekcji, najczęściej 10 mM Tris-HCl

- startery (R i F) — jednoniciowe oligonukleotydy — łącząc się z fragmentem DNA umożliwiają jego powielanie polimerazie. Sekwencja starteru „forward" winna być zgodna z początkowym fragmentem DNA, starteru „reverse" komplementarna do końca fragmentu DNA. Użyte startery nie powinny zawierać ciągu puryn bądź pirymidyn. Ważny jest również brak odwróconych powtórzeń. Sekwencja stareterów ponadto powinna być unikalna. Starter R nie powinien być komplementarny do starteru F.

— trifosforany nukleotydów (dNTPs) — mieszanina równych ilości poszczególnych trifosforanów deoksyrybonukleotydów, z których syntezowane są nowe nici DNA.

— jony dwudodatnie magnezu — są wiązane przez DNA i grupy fosforanowe nukleotydów. Ponadto aktywują polimerazę.
         — termostabilna polimeraza.

Bibliografia:

B. Alberts: „Podstawy biologii komórki"

T.A.Brown: „Genomy"

Po przeczytaniu tego tekstu, czytelnicy często wybierają też: W obronie rozumu Kampania uciszenia krytyków islamu przez skrajną lewicę

Comment on this article..   See comments (5)..

Send text to e-mail address..

Print-out version..    PDF    MS Word

Bartosz Piekaruś Student biotechnologii na Politechnice Śląskiej. Finalista olimpiad: ekologicznej, chemicznej.